sejarah perkembangan kromatografi

Alat Kromatografi adalah suatu alat umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan fasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Pada tahap awal alat kromatografi cair menggunakan kolom dari gelas dengan diameter 1 sampat 5 cm dengan panjang 50 sampai 500 cm dan phase diam berdiameter 150-200 m. Laju alir sangat lambat, sehingga pemisahan sering sampai berapa jam bahkan ½ hari. Hal ini jelas kurang menguntungkan, maka diusahakan cara-cara mempercepat pemishan. Usaha tersebut adalah dengan menggunakan pompa untuk mengalirkan fase gerak, ternyata efisiensi pemisahan menjadi turun dan hal ini dapat diatasi dengan memperkecil ukuran partikel fase diam. Sejak tahun 1960, sudah ditemukan teknologi pembutan partikel fase diam m. Dengan fase diam dengan diameter kecil sampai 10 partikel-partikelnya kecil memerlukan tekanan yang tinggi agar laju alir menjadi besar. Pada tahun 1967-1969, Kirland, Huber dan Havarth memperkenalkan prinsip serta alat kromatografi cair dengan tekanan 5000 psi (300 atm). Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Alat kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat alat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan alat kromatografi gas dan alat kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai alat dan metode kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an alat dan metode kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu alat dan teknik analisis yang canggih. Di awal abad ke-20, kimiawan Rusia Mikhail Semënovich Tsvet (1872-1919) menyiapkan kolom yang diisi dengan serbuk kalsium karbonat, dan kedalamnya dituangkan campuran pigmen tanaman yang dilarutkan dalam eter. Secara mengejutkan, pigmen memisahkan dan membentuk lapisan berwarna di sepanjang kolom. Ia menamakan kromatografi pada teknik pemisahan baru ini (1906). Kemudian kimiawan dari Swiss Richard Martin Willstätter (1872-1942) menerapkan teknik ini untuk risetnya yakni khlorofil untuk menunjukkan manfaat teknik ini, dan sejak itu banyak perhatian diberikan pada kromatografi. Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggukan alat kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi peroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu alat dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi. Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponen. Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan fasa stasioner (padatan atau cairan). Campuran ditambahkan ke kolom dari ujung satu dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengemban yang cocok (fasa mobil). Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fasa mobil dan fasa diam (stationer). Komponen utama kromatografi adalah fasa stationer dan fasa mobil dan kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil dan mekanisme pemisahannya. Beberapa contoh kromatografi yang sering digunakan di laboratorium diberikan di bawah ini. a. Kromatografi partisi

Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat diterapkan pada sistem multikomponen yang dibahas di bagian sebelumnya. Dalam kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul pelarut yang mengisi ruang antar partikel yang ter adsorbsi. Contoh khas kromatografi partisi adalah kromatografi kolom yang digunakan luas karena merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organik (Gambar 12.3). Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sammpel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan. Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat etralrut dengan persamaan berikut. R = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil). Gambar 12.3 Diagram skematik kromatografi b. Kromatografi kertas

Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan. Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka. Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi. Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut. c. Kromatografi gas

Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair). Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini. Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu. Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini. Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif. d. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Tehnik pemisahan dalam kromatografi melibatkan dua fasa, yakni fasa diam yaitu padat atau cairan yang terikat pada padatan pendukung, dan fasa gerak yang berupa gas dan cair. Proses pemisahan dalam kromatografi di dasarkan pada perbedaan laju migrasi masing-masing komponen dalam sistem kromatografi. Perbedaan laju migrasi dari masing-masing komponen merupakan akibat dari perbedaan keseimbangan distribusi masing-masing komponen diantara fasa gerak dan fasa diam. Metode kromatografi dibedakan dalam beberapa macam, berdasar pada fasa gerak, fasa diam, mekanisme, dan tehnik yang digunakan dan salah satu diantaranya adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). Dalam kromatografi cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan, sedangkan fasa diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom tertutup (melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Maksud dan tujuan analisis dengan kromatografi yaitu didapatnya pemisahan yang baik demikian halnya dalam HPLC diharapkan pemisahannya baik dan dalam waktu proses yang relative singkat. Untuk mencapai Tujuan analisis ini, maka dipilih pelarut pengembang yang sesuai dengan komponen yang dipisahkan, kolom yang digunakan juga harus diperhatikan, dan detector yang memadai. Selain dari beberapa factor ini, hal utama yang harus diperhatikan adalah pengetahuan yang baik mengenai HPLC serta pengalaman dan keterampilan kerja yang baik. Pelarut yang digunakan dialirkan terus menerus secara kontinyu ke dalam pompa. Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada lima factor, yaitu waktu retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, resolusi, dan factor ikutan. Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat konsentrasi maksimum. Faktor kapasitas (k’) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika nilai k’ kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k’ yang lebih besar, maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan puncaknya melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k’ optimum, yaitu antara 1 sampai 10. Kolom dinyatakan baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai selektivitas (α) harus lebih besar daripada 1., dimana semakin besar nilai α maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai α dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak (misal: memperbesar polaritas); mengubah fasa diam; mengubah temperature, karena pada umumnya kenaikan temperature akan memperkecil waktu retensi; dan mengubah bentuk komponen. Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat. Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi ‘R’ (ukuran besar kecilnya pemisahan). Jika nilai R ≥ 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik. Sedangkan factor terikutan (Tf) merupakan ukuran kesimetrisan suatu puncak. Dengan catatan nilai Tf < 2,0. Perkembangan HPLC berkembang dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke arah yang lebih luas, yaitu proses pemisahan yang berasaskan afinitas. Filtrasi gel dan ion yang berpasangan., akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan di dalam kolom disertai pemakaian pelarut pengembang dengan tekanan tinggi (Ahmad dan Suherman, 1995). Kromatogram HPLC merupakan relasi antara tanggapan detector sebagai kordinat dan waktu sebagai absis dalam sistem koordinat Cartesian, dimana titik nol dinyatakan sebagai saat dimulainya injeksi sampel (Ahmad dan Suherman, 1991). Berikut dapat dilihat susunan peralatan HPLC, yaitu : 1. Tempat peletakan fasa gerak (reservoir) Pada tempat fasa gerak kebersihannya harus terjaga, agar tidak ada zat-zat pengotor yang dapat mengotori pelarut. Fasa gerak (pelarut) bermacam-macam kepolaritasannya. Sebab diharapkan agar komponen yang akan dipisahkan memiliki sifat yang sama dengan pelarut, sehingga zat tersebut dapat terpisahkan. 2. Pompa Untuk mengalirkan fasa gerak digunakan pompa, yang akan mengalirkan fasa gerak ke dalam sistem. Pompa yang baik adalah pompa yang dapat memompakan fasa gerak secara konstan, memiliki batas tekanan maksimal yang cukup tinggi (3000-6000 Ф), tidak mengandung bahan yang reaktif terhadap pelarut, cara kerjanya sederhana, mempunyai noise yang rendah, dan mempunyai fluktasi tekanan minimal. 3. Injector Ketepatan jumlah volume yang diijeksikan sangat penting untuk analisi kuantitatif. Oleh karena itu, tipe injector yang digunakan pada HPLC adalah injector dengan pipa dosis. Suatu injector dikatakan baik apabila memiliki keberulangan yang tinggi, mudah digunakan, dan dapat digunakan pada keadaan dimana tekanan balik pada kolom relative lebih tinggi. Agar injector tetap awet, maka setiap selesai analisa injector dicuci dengan menggunakan pelarut (fasa gerak) yang digunakan, dan jangan mengganti posisi injector dengan posisi load ke posisi injek karena dapat menyebabkan seal pada injector cepatrusak atau aus. 4. Kolom Kolom merupakan area terjadinya pemisahan komponen-komponen yang dianalisa. Sama halnya dengan injector, setelah menganalisa kolom harus dicuci, dan direndam dalam pelarut organic yang sesuai. Jika fasa gerak yang digunakan diganti dengan yang kepolaritasannya berbeda maka harus menggunakan pelarut perantara dalam kolom tersebut. Laju alir pelarut pun perlu diperhatikan, sebab jika laju alirnya tinggi dapat menyebabkan kolom rusak atau tersumbat. 5. Detektor Detektor digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil pemisahan. Suatu detector harus memiliki kepekaan tinggi; limit deteksi kecil; noise rendah, stabil dan mempunyai keberulangan naik; tidak terpengaruh oleh perubahan suhu, dan yang terpenting memberikan respon terhadap bermacam-macam jenis senyawa. 6. Recorder Recorder berfungsi sebagai sistem pencatat yang mampu menampilakan kromatogram dengan jelas tepat dan cukup peka. Recorder ini mampu menampilkan puncak-puncak kromatogram dengan jelas dan tidak terganggu oleh noise listrik. Secara sederhana, desain alat HPLC (HPLC) dapat ditunjukkan pada gambar berikut. Pada penggunaannya, eluen yang akan digunakan dialirkan dengan pump A dan pump B dengan perbandingan volume yang dikontrol melalui monitor. Pelarut-pelarut tersebut akan melalui degassit untuk menghilangkan gelembung-gelembung udara dalam pelarut tersebut. Sampel yang ingin dianalisis diinjeksikan melalui injektor dan akan bercampur dengan eluen didalam mixer yang selanjutnya akan mengalir menuju kolom untuk dilakukan pemisahan. Out put data akan ditampilkan pada monitor, baik berupa data kualitatif mupun kuantitatif. Data kualitatif diperoleh dalam bentuk spktrum dengan cara membandingkan dengan spktrum standar sehingga dapat diidentifikasi suatu zat atau senyawa. Sedangkan data kuantitatif langsung ditunjukkan pada layar berupa kadar atau konsentrasi suatu zat yang ingin ditentukan. Kelebihan HPLC Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain: ü Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran ü Mudah melaksanakannya ü Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi ü Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis ü Resolusi yang baik ü Dapat digunakan bermacam-macam detektor ü Kolom dapat digunakan kembali ü Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis. ü Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas ü Banyak pilihan fasa geraknya Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam HPLC Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus. e.Kromatografi penukar ion

Kromatografi penukar ion menggunakan bahan penukar ion sebagai fasa diam dan telah berhasil digunakan untuk analisis kation, anion dan ion organik. Kromatografi pertukaran ion adalah salah satu teknik pemurnian senyawa spesifik di dalam larutan campuran.Prinsip utama dalam metode ini didasarkan pada interaksi muatan positif dan negatif antara molekul spesifik dengan matriks yang barada di dalam kolom kromatografi.Metode ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ilmuwan bernama Thompson pada tahun 1850.Secara umum, teradapat dua jenis kromatografi pertukaran ion, yaitu: 1. Kromatografi pertukaran kation, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan positif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan negatif.Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang mengandung gugus karboksil (-CH2-CH2-CH2SO3- dan -O-CH2COO-). Larutan penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah asam sitrat, asam laktat, asam asetat, asam malonat, buffer MES dan fosfat. 2. kromatografi pertukaran anion, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan negatif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan positif.Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang mengandung gugus -N+(CH3)3, -N+(C2H5)2H, dan –N+(CH3)3.Larutan penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah N-metil piperazin, bis-Tris, Tris, dan etanolamin. Metode ini banyak digunakan dalam memisahkan molekul protein (terutama enzim).Molekul lain yang umumnya dapat dimurnikan dengan menggunakan kromatografi pertukaran ion ini antara lain senyawa alkohol, alkaloid, asam amino, dan nikotin. sumber : http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/kimia_dasar/pemurnian-material/kromatografi/ http://teenagers-moslem.blogspot.com/2011/02/high-perfomance-liquid-chromatography.html http://id.wikipedia.org/wiki/Kromatografi_pertukaran_ion